Enzimska Imunoassay ELISA


Enzimski imuno (ELISA) - Moderna laboratorijska istraživanja u kojima su tražili specifična antitijela ili antigena u krvi na određenim bolestima identificirati ne samo etiologiju, ali i fazu bolesti. Rezultati ELISA se može činiti kvalitativno i kvantitativno.

Danas ELISA koristi se u sljedećim situacijama:

1) Traži specifičnih protutijela na bilo zaraznih bolesti;
2) antigeni Pretražite sve bolesti (zarazne spolne);
3) proučiti hormonski status pacijenta;


4) ispitivanje tumorskih markera;
5) za ispitivanje prisutnosti autoimunih bolesti.

Prednosti ELISA metode:

1) visoka specifičnost i osjetljivost ELISA (preko 90%).
2) Sposobnost za određivanje i praćenje dinamike procesa bolesti, odnosno uspoređujući broj antitijela u različitim vremenskim intervalima.
3) Dostupnost ELISA dijagnostike u bilo medicinske ustanove.

Relativan nedostatak:

1) Detekcija imunološkog odgovora (antitijela), ali ne i od patogena.

Osnovni pojmovi

Prije pojasniti suštinu metodom ELISA, ukratko razumjeti neke koncepte.

Antitijela (ili imunoglobuline - Ig) - Specifični proteini koje proizvode B -
limfociti (imunološke stanice) kao odgovor na hit u tijelu zaraznih uzročnika (virusa, bakterija, gljivica i sl.) Postoji imunoglobulin A (IgA), imunoglobulin E (IgE), imunoglobulin M (IgM), imunoglobulin G (IgG), imunoglobulin D (IgD). Oni se razlikuju jedni od drugih i čine molekulske mase, polu-život, sudjelovanje / nesudjelovanje u zaraznog procesa, vremena detekcije nakon infekcije. Ako uzmemo u obzir molekularne težine, najviše On IgM - to pentamer (950 000 Daltona) za razliku od drugih Ig (150-200 000 Yes), pa IgM jednostavno ne mogu proći kroz placentu. Stoga, otkrivanje IgM u djece 1 godine života je uvijek znak infekcije u fetusa. Serum imunoglobulini predstavljao većinu toga IgG (75-85%), a najniža - IgE (0003%). U zarazne proces trajati samo izravan dio IgA, M, G. IgE znak alergijske reakcije i bolesti, i IgD - može se naći samo u limfnim čvorovima i krajnici tkiva, igra važnu ulogu u formiranju lokalne imunitet.

Nastava imunoglobulina

Antigeni - Makromolekularni tvari organskog podrijetla, uključujući infektivne i druge bolesti, kao što su razne tvari mijenjati stanice jednog ili drugu bolest (autoimuna oboljenja, onkologiji).

Imunokompleks - Kompleksa antigen-antitijelo koji je uključen u imunološkom procesu.

Što metoda temelji ELISA.

Postoji nekoliko vrsta ELISA (izravne, neizravne metode blokiranja, konkurentne), ali u praksi se često koristi heterogenu čvrste faze imunološkog analize ili ELISA (imunoenzimskim testom)

Osnova ELISA imuni odgovor antigena i antitijela u obliku imunokompleksa: antigen-antitijelo, što rezultira promjenom u enzimskom aktivnošću specifičnih oznaka na površini antitijela.

Metoda IFA

U jednostavnim uvjetima, taj proces može se podijeliti u nekoliko faza:

1) površine rupe tableta liječnik ispitivač antigenje specifičan patogen. Dodavanjem biološkog materijala (krv seruma) je pacijent specifična reakcija između antigena i željenog antitijela (imunoglobulina). Ova veza će djelovati kao "poseban antigen" u sljedećoj fazi.

2) U ovoj fazi je formiranje IR (Imunološki kompleksi) - reakcija između "specifičan antigen" i konjugata (imunoglobulina je označena enzim peroksidaza). Posebna kromogena dodaje. Rezultat ove enzimske reakcije je formiranje obojenih tvari u otvor u ploči, intenzitet boje ovisno o količini koja se nalazi u materijalu od bolesnika imunoglobulini (antitijela).

3) Zatim, ukupni rezultat: fotometryrovanye pomoću višekanalni spektrofotometar, uspoređujući optičku gustoću materijala kontrolnih testova optička gustoća ispitivanja, matematički obradu rezultata. Broj antitijela u pacijenta ovisi o visini optičke gustoće od bunara.

Obično u praksi, koristeći ploče s 96 jažica.

Kada mjerenjem optičke gustoće (OP) broji broj ispitivanog tekućine (ili koncentracija) antitijela u određenom jediničnom volumenu. Rezultati se usporediti s kontrolnim uzorkom.

To treba imati na umu:za svaki ispitni sustav razvijen pojedinačne pokazatelje za računovodstvo rezultatima, normama uspješnosti i patologije (tj "referentna vrijednost"). To treba uzeti u obzir prilikom ocjenjivanja rezultata svakog pojedinog studija. Pogrešno interpretirati rezultate jednog laboratorija na "vrijednosti" drugom laboratoriju. Također netočno uspoređivati ​​rezultate različitih laboratorija s drugima.

Prilikom postavljanja ELISA reakcije i važne pojmove poput antitijela avidnosti.
Sklonost protutijela - Ovo je jačina veze s antigenom i antitijela i antigena količini koja je u svezi sa immnohlobulinami (antitijela). Sklonost je važno u procjeni predviđeni vrijeme zaraze koja je iznimno važno u dijagnostici primarne infekcije u trudnica.

Osnova antitijelo aviditeta ispitivanja sastoji se od obrade imunog kompleksa (antigen-antitijelo) otopinu uree uništiti proteina. Vysokoavidni veze ostaju netaknuti i nyzkoavidnyh uništena. Rezultat je dan u obliku indeksa aviditeta, izražen kao postotak (%).

Koje bolesti otkriven ELISA dijagnostike?

1. Infekcije
1.1 Virusni hepatitis (IgM, G), B antigene -HBsAg, HBsAg, protutijela IgM - HBcorAg, Ig, ukupni HBcorAg IgG HBeAg), C (antitijela Ig M, G HCV), D (IgM, G), E (Ig M, G), i drugi.
1.2 HIV infekcija (IgG)
1.3 Tsytomehalovyrusnaya infekcije (protutijela IgM, G)
1.4 Epstein-Barrov virus infekcija ili mononkleoz (antitijela IgM, G, EA VCA, NA proteini virusa)
1,5 herpetičkih infekcije (protutijela IgM, G)
1,6 toksoplazmoza (protutijela IgM, G)
1,7 Rubeola (IgM, G)

1,8 Ospice (IgM, G), bruceloze (IgM, G), pseudotuberculosis (IgM, G), salmonellezom (IgM, G), Shyhellez ili dizenterije (IgM, G), aspergilozu (IgM, G), krpeljnog encefalitisa i borreliozu mnogi drugi.
1,9 parazitoze (giardiasis, toxocarosis, trihinoza, opisthorchiasis, echinococcosis, alveokokkoz i drugi) u kojima IgG otkrivena
1.10 STD (bolesti prenose spolno) - mikoplazmoza (IgM, G), ureaplasmosis (IgM, G), klamidija (IgA, M, G), sifilis (IgG)
1.11 pylori infekcije (IgG)

2. Biljezi autoimunih bolesti i ljudski imunološki parametri (ukupno IgE, IgG ukupno, ukupno IgA, IgM ukupno, ukupno IgD, izlučivanje IgA, IgG 2, IgG4, SIP-cirkulira imuni kompleksi, IgA i IgG za glutenski epitopi, itd)

3. Onkolohichsekie biljezi (TNF - faktor tumorne nekroze, AZO - karcinoembrionski antigen, PSA - prostatspetsyfichnyy antigena hCG - humani korionski gonadotropin, CA 125, alveomutsin i mnogi drugi)

4. reproduktivnih poremećaja (estradiol, progesteron, prolaktin, testosteron, AFP- alfafetoproteyn, FSH - folikul-stimulirajućeg hormona) i drugi

5. štitnjače (slobodni i vezani T3, T4, tireoglobulin, tireoperoksidaze - TPO, štitnjače-stimulirajući hormon - TSH).

Ovaj popis je prikazan nisu sve bolesti dijagnosticira pomoću ELISA.

Materijal za ELISA analize i pravilima ograde

Najčešći materijal za ELISA reakcije - pacijenta serumu, uzima na prazan želudac. Materijal može poslužiti i kao likvora, amnionske tekućine, staklastih sadržaja, sluzi grlića maternice i uretre briseva.

Priprema bolesnika za isporuku materijala za ELISA

Krv se uzima na prazan želudac. Prije bilo krvi ne treba poduzimati nikakve lijekove. Specifično liječenje (antibakterijska, antivirusna, protyvoparazytarnoe itd) treba prestati najmanje 2 tjedna prije istraživanja.

Uvjeti IFA proizvodnja

Enzimska Imunoassay materijal je brz, preko noći. Kašnjenja mogu biti u različitim laboratorijima zbog nakupljanja većeg broja seruma.

Mogući rezultati ELISA dijagnostike

U procjenjivanju rezultata na određene infekcije važno klase protutijela i njihov broj. Na to ne ovisi samo etiologije infekcije (ili ne moraju), ali također predvidjeti stadij bolesti (akutne, kronične), te prisutnost aktivne infekcije (akutni ili kronični), pogoršanje u vrijeme istraživanja.

Što su približne vrijeme pojave antitijela (imunoglobuline - Ig)?

Najraniji protutijela IgM. Prepoznajte oni mogu biti 1 do 3 tjedan nakon moguće infekcije, karakterizaciju akutne faze infekcije. Druga situacija je pojava protutijela IgM - aktivacija (ili pogoršanje) kroničnog procesa. IgM antitijela cirkuliraju u prosjeku oko 3 mjeseca, a onda se njihov broj postupno nestaje. Međutim, kod nekih pacijenata, u tragovima količine IgM može pojaviti u 1-2h godina infekcije.

Moderni sustavi za ispitivanje s visokom osjetljivošću, što je rezultiralo lažno pozitivni rezultati su nespecifični (često u trudnica). Dakle, u ovoj skupini bolesnika pozitivnih IgM treba ispitati!

IgA antitijela se pojavljuju 2-4 tjedna nakon infekcije, ali u količini koja je dovoljna da se identificiraju - u mjesecu. Serum IgA sintetiziraju plazma stanica u slezeni, limfnim čvorovima i sluznice, sekretorskim IgA koncentrirane u sluznicu obavljati svoju funkciju - sudjelovanje u lokalnoj imunitet.

Od 4. tjedna nakon infekcije početi prikazivati ​​protutijela IgG. U većina infekcija titra postupno povećao s maksimumom na različitim vremenima (u prosjeku 1,5-2 mjeseci), a zatim titar ostaje na niskoj razini i ukazuje na imunološki sustav. U nekim bolestima (mikoplazmoza, klamidija, Trihomonijaza) razina IgG nije visoka, značajno se smanjuje zbog nedostatka imuniteta u ovih infekcija.

Mogućnosti za detekciju protutijela različitih klasa:

- Izolirana otkrivanje IgM antitijela pretpostavlja da je primarni

infekcije.
- Simultano otkrivanje IgM i IgG krvi tipično za primarne infekcije
U zadnje 2-3 mjeseci, kao što je pogoršanja kroničnih bolesti. Dakle, prisutnost IgM u trudnoći nije uvijek znak primarne infekcije.
- Identifikacija izoliranih IgG može ukazivati ​​kako imunitet na bolest,
i kronične infekcije. U drugoj situaciji je važan i broj antitijela (titra) i promjenu dinamike titra. Tipično, studija provedena u razmaku od 2-4-6 tjedana.

- Otkrivanje IgA ili IgM izolacije ukazuju primarne infekcije. Na
Pojava IgA s IgG očekuje aktivaciju kronične infekcije (u prosjeku dva tjedna od datuma pogoršanje).

Određivanje sklonosti IgG antitijela je izvrstan komplementarni stadij dijagnoza primarne infekcije iz stare infekcije koja ima svoje kliničko značenje, osobito u procjeni rizika od intrauterine infekcije fetusa. Otkrivanje IgG nyzkoavidnyh pokazuje primarne infekcije i prosječno 4-6 mjeseci nakon infekcije, rijetko duže. Nyzkoavidnyh IgG zahtijevaju drugi laboratorijski dokaz primarne infekcije (IgM). Vysokoavidni antitijelo je bilo znak kronične bolesti i njezin pogoršanje, odnosno formira imunitet.

Značajke u dojenčadi:djeca do godinu dana, a ponekad i 1,5 godine u majčine krvi kruži IgG na infekcije (to je njihov prodor kroz placentu od majke na fetus u maternici). To samo po sebi nije znak infekcije sadašnjosti. Ako takjm dob IgM (podsjetiti da majčinska IgM prodrijeti u posteljicu ne može), onda je to znak infekcije fetusa ili infekcije stečene nakon rođenja.

Kvantitativna ELISA metoda

Rezultat ELISA dijagnostike (pomoću ELISA analizator) pojavljuje se u nekim jedinicama:
- Optička gustoća (OP) uzorak - koncentracija specifičnih antitijela u jediničnom volumenu. Viši uzorci OP, veća koncentracija antitijela. Neki rezultati se odnosi na omjer pozitivnosti (CP) - to je optička gustoća uzorka.
- Jedinica koncentracije antitijela (nanohramm / mililitar ili ng / ml).
- U titra seruma: 1:20, 1:40, 1: 100, 1: 200, 1: 400, 1: 800, 1: 1200 i tako dalje. Dijagnostički titar (u kojoj je bolest dijagnosticirana, a ne činjenica infekcije) za različite bolesti su različiti.

- U obliku simbola - "+", "-", (+, ++ +++, ++++)? "".
- U kvalitativno ocjenjivanje određenom kriteriju (pozitivan ili negativan).

Ispravno procijeniti količinu otkrivanje protutijela IgG klase opciju i, dakle, postaviti pozornicu za bolesti i potrebe za liječenje može samo liječnik.

Ne smijemo zaboraviti da je za svaki ispitni sustav razvijen od strane njihovih "vrijednosti" (varijanta pravila), iznad kojih je dijagnosticirana i određene bolesti (patologija opcija). Za različite sustave za ispitivanje "vrijednosti" su različite.

Ispravna uspoređuju rezultati IFA, uzeti u dinamici, moguće je samo u slučaju proizvodnje u istom laboratoriju.